世界帕金森病日剪刀手CRISPR

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研究背景

帕金森病是全球第二高发的神经退行性疾病，其发病率逐年升高，据预测，年全球帕金森病患者人数将超过一千四百万。

帕金森病主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失，及路易小体的形成，累及黑质-纹状体多巴胺系统功能障碍，纹状体多巴胺水平降低，出现肌肉僵直、静止性震颤、运动迟缓、姿势障碍等运动症状，此外，亦引发抑郁、便秘、失眠、抑郁、焦虑、认知障碍等非运动症状，严重危害人类健康。

目前，帕金森病病因及发病机制并不明确，并且临床上没有有效延缓、阻止或翻转帕金森病病程的药物或治疗手段。帕金森病患者黑质多巴胺能神经元不断凋亡，而患者症状也不断恶化。患病早期尚可在药物治疗下正常工作、生活，而后期患者症状严重，直至不能起床，最终死于以肺炎为主的各种并发症。现阶段帕金森病治疗主要以药物治疗为主，而一线治疗药物左旋多巴也因开关效应、震颤麻痹等副作用，及长期使用疗效减退的原因，无法长期用于帕金森病治疗。脑深部电刺激、干细胞疗法及基因疗法等新型科技开始涌现。

威廉?理查?高尔斯绘制的帕金森病插图，此图首见于年出版的《神经系统疾病手册》（AManualofDiseasesoftheNervousSystem）

年4月8日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杨辉团队在Cell杂志发表《Glia-to-NeuronConversionbyCRISPR-CasRxAlleviatesSymptomsofNeurologicalDiseaseinMice》的研究论文，创新性利用运用最新开发的RNA靶向CRISPR系统CasRx特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达，可实现神经胶质向视网膜神经节细胞转变，永久性视力损伤模型小鼠的视力；高效特异地将纹状体星形胶质细胞转化为具多巴胺能神经元特性的神经元，显著改善小鼠运动功能障碍，为帕金森病基因疗法提供坚实基础。

图片来源：Cell

运用最新开发的RNA靶向CRISPR系统CasRx特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达

研究思路

敲低Ptbp1基因实现胶质细胞向视神经节细胞转换，部分恢复受损视觉信号

CRISPR/Cas9基因编辑技术自从问世以来，在多个领域取得突破性发现。然而因CRSIPR/Cas9是永久性改变DNA且存在潜在的脱靶效应；近几年，CRISPR-CasRx基因技术编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式。此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。

研究团队首先在体外细胞筛选了高效抑制Ptbp1表达的gRNA，设计了特异性在穆勒胶质细胞中表达CasRx的系统。利用AAV包裹gRNA注射至视网膜下，在小鼠穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达。

图片来源：cell

约一个月后，研究团队检测到视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转化而来的视神经节细胞可以产生正常细胞对光刺激的电信号。研究人员随后发现，转化来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑，实现了这一目标后，研究团队随后检测该转换过程重构的视觉信号通路能否恢复小鼠受损信号传导。研究人员在视神经节细胞损伤的小鼠模型中验证，发现转化来的视神经节细胞可实现让永久性视力损伤的小鼠重构光敏感性，实现了一个技术性突破：即胶质细胞向神经元转化治疗的潜能。

图片来源：Cell

敲低Ptbp1基因实现纹状体星形胶质细胞向多巴胺能神经元特性神经元转换

黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失，累及纹状体多巴胺能投射减少，降低纹状体多巴胺水平，从而出现帕金森病运动症状。星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多的细胞，研究团队在实现胶质细胞向神经元转化后，特异性利用AAV介导的CRISPR-CasRx技术敲低纹状体星形胶质细胞中Ptbp1基因表达，通过DAT（多巴胺转运体）、TH（酪氨酸羟化酶，脑内多巴胺合成的限速酶）荧光定位，及电信号特征发现，敲低Ptbp1后实现了星形胶质细胞向黑质多巴胺能神经元特性的神经细胞的过程。

图片来源：Cell

转化而来的多巴胺能神经元特性神经元恢复小鼠损伤的运动能力接近至正常水平

在6-羟基多巴胺损伤的小鼠帕金森病模型，研究团队利用行为学实验检测发现，敲低Ptbp1基因实现纹状体星形胶质细胞向多巴胺能神经元特性神经元转换一个月后，显著改善小鼠运动功能障碍，甚至接近至正常水平。

图片来源：Cell

亮点分析

帕金森病等神经退行性疾病无疾病修饰（Disease-modifying）药物/手段延缓疾病进程或治愈该疾病，早期帕金森病患者药物组合疗法及运动康复，部分中期患者脑深部电刺激治疗，而很多晚期帕金森病患者无有效药物或手段治疗，病情严重者无法进食，只能通过鼻饲进食，甚至无法起床，最终走向生命的终结。而现行药物因副作用及长期应用药效减退等原因，无法长期使用；电刺激存在潜在的脑损伤风险，同时晚期重症患者效果不佳；干细胞及基因疗法具有广泛的前景，但目前尚无突破性成果，且并未进入临床治疗阶段。

本研究中利用CRISPR-CasRx技术敲低敲低Ptbp1基因表达，创新性实现了纹状体星形胶质细胞向多巴胺能神经元的转化，实现了从根本上治愈帕金森病的可能性；同时基于中枢神经星形胶质细胞丰富的含量，及避免潜在外源细胞排斥风险的现状，该研究为帕金森病基因疗法及帕金森病治疗一潭死水注入新活力。尽管如此，化学损伤类啮齿类帕金森病动物模型和人类帕金森病患者生理病理状态仍存在不同之处，后续灵长类动物实验或其他实验仍需要进一步验证该治疗效果。但该研究取得的惊人帕金森病治疗效果，给予后续临床前及可能的临床实验喜人的曙光。

此外，本研究实现神经胶质向视网膜神经节细胞转变，缓解永久性视力损伤模型小鼠的视力，提示该研究不仅仅针对帕金森病及视神经损伤治疗，具有多种神经退行性疾病、脑损伤潜在的治疗效果。

延伸阅读

杨辉，现任中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心研究员、灵长类疾病模型研究组组长、博士生导师。上海交通大学生物学学士，中科院生化所博士，麻省理工学院Whitehead研究所博士后，国家杰出青年基金获得者。该论文的通讯作者杨辉研究员在美国麻省理工Whitehead研究所RudolfJaenisch课题组做博士后，主要研究方向为基因编辑与干细胞，年回国担任中国科学院神经科学研究所灵长类疾病模型研究组组长，主要主要围绕新型基因编辑技术的脱靶安全性问题以及在动物模型的建立和疾病治疗中的应用，获得了一系列原创性成果，在Nature、Science、NatureNeuroscience、DevelopmentalCell、CellResearch、ProteinCell等期刊发表通讯/共同通讯作者文章十余篇，先后获得「中源协和生命医学创新突破奖」、「何梁何利科技进步奖」等，相关成果入选年度中国生命科学十大进展，年获得国家杰出青年科学基金资助。

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