独家原创视网膜色素上皮细胞移植治疗年龄相

专家介绍：方攀峰

博士，现任江苏艾尔康生物医药科技有限公司副总兼技术总监，江苏省青年科技工作者协会会员，ClinicalTrialsinDegenerativeDiseases（CTDD）杂志编委，年度省“双创计划”企业创新人才，年度无锡市产业升级创新领军人才。曾在德国马克思-普朗克发育研究所做交换博士生，在耶鲁大学以博士后、副研究员身份工作十余年。主要从事细胞生物学、发育生物学研究。曾获邀担任JBC、PLoSONE等数十本科研杂志的特约评审，参与评审同行论文共30余次。年回国后开始从事眼科疾病治疗1类新药开发，针对目前无药可医且市场巨大的干性黄斑病变疾病，开辟了一条全新的治疗途径，其研究进度居于世界前列。

正文

视网膜色素上皮细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性的临床研究及相关药物开发

[摘要]年龄相关性黄斑变性（AMD）是视网膜色素上皮（RPE）细胞萎缩或功能异常造成的一种视网膜退行性病变，其最终导致感光细胞功能退化和凋亡，引起视力损伤甚至造成失明，是世界三大致盲性疾病之一。近年来，外源RPE细胞移植替代疗法是目前治疗AMD疾病的突破性疗法。就3种不同来源的RPE细胞在治疗AMD等视网膜退行性病变中的临床研究进展和药物开发情况进行综述。

视网膜病变是导致失明的主要因素之一。其中，年龄相关性黄斑变性（age-relatedmaculardegeneration，AMD）是导致老年人群失明的最常见的视网膜病变，干性（非渗出性）AMD约占患者总数的80%，临床以玻璃疣、地图样萎缩和光感受器变性为典型症状。目前临床尚没有任何有效治疗方法。湿性（渗出性）AMD常与异常的脉络膜新生血管有关。目前最常用的治疗方法是玻璃体内注射血管内皮生长因子（VEGF）抗体，通过抑制新生血管达到延缓疾病进展的目的。但多数患者在治疗一段时间后都会发生瘢痕纤维化，使得VEGF抗体类药物治疗失效。

视网膜色素上皮（retinalpigmentedepithelium，RPE）细胞是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层多边形细胞，RPE细胞在眼的发育和视觉功能中发挥着重要作用，例如：维持血-视网膜屏障、分泌多种生长因子、参与视循环代谢、吞噬视细胞脱落的外节盘膜等。因此，维持RPE细胞的完整性对正常的视网膜功能至关重要。视网膜病变多与RPE细胞的萎缩或功能异常有关。

小分子化药和大分子抗体药，目前尚不能延缓或逆转RPE细胞的损伤。细胞替代疗法被认为是治疗AMD的有效治疗手段，细胞类型可分为非RPE细胞和RPE细胞两大类。非RPE细胞主要包括间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）、虹膜色素上皮细胞（irispigmentepithelium，IPE）等。由于RPE细胞的功能复杂，这些非RPE细胞并不具备RPE细胞的完整生理功能，有些甚至会产生严重的医疗事故。因此，使用具有生理功能的RPE细胞进行替代疗法逐渐成为业内共识。而RPE细胞也有多种来源：1）胚胎干细胞（ESC）诱导分化的RPE细胞；2）诱导多能干细胞分化的RPE细胞；3）眼组织来源的RPE细胞，取材于胎儿和成人眼组织。本文将着重介绍更容易成为细胞药物的RPE细胞，讨论其在视网膜病变临床研究和药物开发中的进展。

细胞药物是指含有人类细胞或组织，可通过植入、移植、静脉输注等方式转入受者体内的产品。美国年实施的《公共卫生服务法》（PublicHealthService，PHS），根据细胞药物毒副作用危险性从高到低分别按照第条和条条款进行监管。RPE细胞药物属于监管更为严格的PHS类产品，需要符合HCT/Ps21CFR第、s、、和等条款的要求。同样，原国家食品药品监督管理总局（CFDA）于年发布的《药品管理法（修订稿）》明确要求细胞治疗类产品需按照药品注册上市。结合《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》、《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》、《干细胞临床研究管理办法》以及《年龄相关性黄斑变性治疗药物临床研究技术指导原则》等配套法规和指导原则，从细胞来源、制备、临床前研究到临床试验全过程都提出了明确要求。欧盟、日本等也都有类似的法规，因此，RPE细胞治疗按照药品注册上市使用已成为国际共识。

1外源RPE细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性的机制

虽然不同研究者制备RPE细胞的来源不同，但其最终治疗方式都是将体外获得的外源RPE细胞植入患者视网膜黄斑区，以替代或补充患者萎缩受损的自身RPE细胞，恢复RPE细胞的生理功能，改善患者视力。外源RPE细胞治疗视网膜变性的机制尚不是很明确。根据现有研究，其可能治疗机制包括：1）旁分泌（paracrine）效应。植入的外源RPE细胞能够分泌多种细胞因子，如转化生长因子（TGF）-β、胰岛素样生长因子（IGF）-1、睫毛神经营养因子（CNTF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、色素上皮衍生因子（PEDF）等，部分细胞因子进入宿主残存的感光细胞，发挥保护作用。旁分泌效应很可能是患者短期视力改善的主要原因。2）生理结构重建：植入的外源RPE细胞与宿主残存的RPE细胞以及感光细胞完成整合，重建它们之间的连接。同时，结构的改善能够发挥RPE细胞的离子泵功能，改善感光细胞和RPE细胞间的视黄醛-视黄醇的循环，并可改善感光细胞与其相连的其他神经细胞的突触连接。RPE细胞生理功能的恢复可以改善感光细胞生理功能。因此，这一生理结构重建可能是患者长期视力改善的主要原因。3）最新的一项研究表明，外源植入的视网膜祖细胞（retinalprogenitorcells，RPC）能够抑制病变视网膜微环境中小胶质细胞的活化、胶质增生和炎症因子的产生，从而为移植细胞提供更适宜的生长环境，有利于移植细胞的存活和整合，并发挥其生理功能。

区别于传统药物，RPE细胞药物作为活细胞其本身存在动态的变化，当其进入患者眼部后更是受多种因素的影响，加之人眼组织结构的复杂性以及与模型动物的差异，外源RPE细胞移植治疗视网膜变性的机制研究进展缓慢，尚待通过更先进的技术方法进行研究。

2胚胎干细胞来源RPE细胞的临床研究

自年报道人ESC（hESC）可在体外诱导分化形成hESC-RPE细胞以来，人们就开始尝试使用hESC-RPE细胞移植开展视网膜病变相关临床研究。年，美国ACT（AdvancedCellTechnology）公司首次将hESC-RPE细胞植入2名患有视网膜退行性疾病的受试者视网膜下腔。在4个月的随访中，这2名患者均未出现细胞过度增殖、致瘤性、异位组织及明显的排斥反应，且视力均略微提高。据此，该公司后续又开展了多项临床试验。其中，在一项最长随访期长达4年的临床研究中，参与研究的18名受试者中，有超过一半的受试者术后22个月时的最佳矫正视力较细胞移植前明显改善，并且同样未发现移植细胞有异常增殖或其他安全性问题。除此之外，根据美国临床试验数据库（ClinicalTrials.gov）登记信息显示，截至目前共有15项已经完成或正在进行中的临床试验，包括美国RPT（RegenerativePatchTechnologies）、辉瑞（Pfizer）、以色列CCN（CellCureNeurosciences）、韩国CHABiotech，以及我国中科院动物研究所周琪院士团队、陆军军医大学阴正勤教授团队等也开展了基于hESC-RPE细胞移植的临床试验（见表1）。

美国RPT公司于年10月份启动的临床试验计划入组20例，目前仍在进行中。该项临床试验的药物是将ESC来源的10万个RPE细胞附着在高分子材料——聚对二甲苯贴片上，且贴片上的细胞密度接近于生理状态下人眼球中的RPE细胞密度。最后将制备成的细胞贴片通过手术植入受试者视网膜黄斑区。年，该公司公布的初步临床试验结果显示，4例受试者完成RPE细胞贴片的移植。其中1例受试者最佳矫正视力可见字母数较基线提升了17个字母，另有2例受试者的视力也略有提高。试验期间共报告3例与研究药物无关的严重不良事件（SAE）。

美国辉瑞公司与英国Moorfields医院合作，同样采用细胞贴片的方式为2名AMD患者进行了细胞移植，这2例受试者术后12个月随访时的最佳矫正视力可见字母数较基线分别提升了29和21个字母。由于手术过程中同时去除了脉络膜新生血管，可能对评估视力改善产生了一定干扰。安全性方面，共报告3次与研究药物无关的SAE。

韩国CHABiotech使用ACT公司的技术，首次以4名亚洲病人[2例为干性AMD，2例为Stargardts黄斑变性（SMD）]为研究对象开展了临床试验。术后1年，2名AMD受试者术眼的最佳矫正视力可见字母数分别提升了1和9个字母，而对侧眼分别下降了6和20个字母。2名SMD患者术眼最佳矫正视力可见字母数分别提升了12和19个字母，对侧眼相应提升了9个字母。安全性方面，4名受试者均出现了一些与服用免疫抑制剂相关的不良事件。但没有发现移植细胞异常增殖、畸胎瘤或其他严重安全性问题。

国内的中科院动物研究所周琪院士带领的团队也开展了一项针对干性AMD的开放、非随机临床试验。试验在医院医院开展。计划完成10例受试者，目前研究正在进行中。

此外，陆军军医大学阴正勤教授团队开展了一项针对湿性AMD的临床试验，该研究重点考察移植细胞的安全性和耐受性。手术过程首先对受试者移除了脉络膜新生血管，然后将细胞植入视网膜下腔。术后随访1年没有观察到移植细胞引起的不良反应。眼科检查发现术眼黄斑受损区域有新生RPE样细胞层，同时视觉和眼电生理功能均有一定程度的改善。

3诱导多能干细胞来源RPE细胞的临床研究

年，研究人员利用诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcell，iPSC）技术经体外诱导分化获得了RPE细胞，即iPSC-RPE细胞。年9月，日本理化研究所首次开展了基于iPSC-RPE细胞移植治疗AMD的临床研究，研究以患者自体皮肤成纤维细胞作为供体细胞，经体外诱导分化获得RPE细胞，并借助生物载体制备成细胞贴片完成细胞移植。研究入组2人，第1名受试者完成手术，术后1年视力没有明显变化，也没有报道与移植细胞相关的不良事件。第2例受试者因细胞存在基因突变而终止。年经日本卫生部批准，该研究重新启动。与之前相比，本次研究供体细胞源自健康志愿者而非患者。细胞移植方式也由细胞贴片改为细胞悬液。目前已完成1名60多岁AMD男性患者的细胞输注。

除了日本理化研究所开展的临床研究外，美国国立卫生研究院国家眼科研究所（NationalEyeInstitute，NEI）按照PHS产品监管要求，从3名AMD患者外周血中分离出CD34+细胞，通过细胞重编程获得临床应用级别iPSC，并分化成临床应用级别的RPE细胞，制备成了细胞贴片。目前已完成了临床前研究，即将向FDA申请开展正式的临床试验。除此之外，ClinicalTrials.gov网站显示还有一些研究者也在开展基于iPSC-RPE细胞移植用于视网膜病变治疗相关的临床研究（见表2）。

4原代视网膜色素上皮细胞的临床研究

早在20世纪90年代，有研究者尝试通过手术移植胎儿来源或患者自体来源的RPE细胞治疗因RPE细胞萎缩或受损引起的视网膜病变。这些研究没有发现与移植细胞相关的不良事件。而且，部分研究取得了令人鼓舞的结果。由于成人来源的RPE细胞的扩增能力弱，自体来源还可能携带疾病基因，所以其产业化进展较慢。相比之下，研究人员发现从胎儿眼底组织分离的原代RPE细胞在体外扩增能力很强，临床应用前景良好。年，袁松涛等报道胎儿来源的RPE细胞具有很强的体外扩增能力，并能保持RPE细胞的特性和表型。胎儿眼底组织来源的RPE细胞分泌的细胞因子，能更有效改善视网膜退行性疾病。因此，胎儿来源体外扩增的RPE细胞是RPE细胞药物的首选。经过多年的发展，RPE细胞的体外培养技术已相对成熟，使得稳定量产原代RPE细胞成为可能，极大推动了原代RPE细胞的药物开发进展。并且，在此基础上，笔者所在团队以细胞药物相关法规为依据，进一步优化了胎儿来源原代RPE细胞体外传代、培养、冻存等环节的生产工艺，同时为不同代次RPE细胞建立了严格的质量标准，从而全面提升了RPE细胞的产量、质量和批次间稳定性，解决了RPE细胞药物产业化障碍。中试规模的多批次生产均获得了符合质量标准的RPE细胞，证明现行工艺稳定、可行。目前，笔者所在公司已联合南京医院、医院、首都医院等开展临床研究。此外，根据ClinicalTrials.gov登记信息，还有其他的一些研究者也在开展类似的临床研究，详见表3。

美国JCyte公司正在开展利用胎儿来源的RPC治疗视网膜色素变性的Ⅰ/Ⅱa期多中心、开放性临床研究。该研究计划入组28例受试者，分为4个剂量组，依次为50万、万、万和万细胞剂量组。术后12个月随访时，所有受试者最佳矫正视力可见字母数的平均提升幅度为3.64个字母。其中，50万细胞剂量组平均提升幅度为1.38个字母；万细胞剂量组平均提升幅度为1个字母；万细胞剂量组平均提升幅度为4.83个字母；万细胞剂量组平均提升幅度为9个字母。安全性方面，21例受试者（占所有治疗患者的75.0%）报告了不同程度的不良事件，不良事件的程度都是轻微至轻度或一过性，未接受干预可自行缓解。

英国ReNeuron公司使用RPC细胞开展了针对视网膜色素变性的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，根据其

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